兔腫瘤浸潤組織中性粒細(xì)胞分離液試劑盒
貨號(hào):P2540
規(guī)格：200ml/kit
保存 ：室溫避光儲(chǔ)存，有效期少 2 年。

試劑盒內(nèi)容 ：

全血及組織稀釋液     100ml
細(xì)胞洗滌液           100ml
試劑A                100ml
試劑F                100ml
紅細(xì)胞裂解液         100ml
說明書               1 份

各種動(dòng)物骨髓細(xì)胞的采集方法
    1. 大鼠、小鼠骨髓的采集：用頸椎脫臼法處死動(dòng)物,剝離出胸骨或股骨，用注射器吸取少量的F液，沖洗出胸骨或股骨中全部骨髓液，以500g（約1800 轉(zhuǎn)/分）離心20 分鐘，棄上清。沉淀以F液重復(fù)洗滌一次后用全血及組織稀釋液懸起（細(xì)胞濃度為2×10 8 -1×10 9 個(gè)/ml），備用。
   2. 大動(dòng)物骨髓的采集：
    A．骨髓穿刺點(diǎn)定位
  （1）胸骨：穿刺部位在胸骨中線,胸骨體與胸骨柄連接處,或選胸骨上1/3 部。
  （2）脛骨：穿刺部位在脛骨內(nèi)側(cè),脛骨上端的下方1 厘米處。
  （3）肋骨：穿刺部位在第5～7 肋骨各自的中點(diǎn)上。
  （4）髁骨：穿刺部位在髁前上棘后2～3 厘米的髁嵴。
  （5）股骨：穿刺部位在股骨內(nèi)側(cè)面,靠下端的凹面處。
B．骨髓穿刺方法
  （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按要求固定，穿刺部位去毛、消毒、麻醉，要求局部麻醉范圍直達(dá)骨膜，也可作全麻。
  （2）操作人員帶消毒手套，確定穿刺點(diǎn)，估計(jì)從皮膚到骨髓的距離并依此固定骨髓穿刺針長度。左手拇、食指繃緊穿刺點(diǎn)周圍皮膚，右手持穿刺針在穿刺點(diǎn)垂直進(jìn)針，小弧度左右旋轉(zhuǎn)鉆入，當(dāng)有落空感時(shí)表示針尖已進(jìn)入骨髓腔。用左手固定穿刺針，右手抽出針芯，連接注射器緩慢抽吸骨髓組織，當(dāng)注射器內(nèi)抽到少許骨髓時(shí)立即停止抽吸，收集骨髓細(xì)胞加入4-5ml F 液混勻，以500g（約1800 轉(zhuǎn)/分）離心20 分鐘，棄上清，沉淀以F 液重復(fù)洗滌兩次后用全血及組織稀釋液懸起（細(xì)胞濃度為2×10 8 -1×10 9  個(gè)/ml），備用。
 （3）左手壓住穿刺點(diǎn)周圍皮膚，迅速拔出穿刺針，用棉球壓迫數(shù)分鐘。如穿刺的是肋骨，除壓迫止血外，還需膠布封貼穿刺點(diǎn)，防止發(fā)生氣胸。
3. 人骨髓的采集：
    臨床方法收集骨髓細(xì)胞加入4-5ml F液混勻，以500g（約1800轉(zhuǎn)/分）離心20分鐘，棄上清，沉淀以F液重復(fù)洗滌兩次后用含20%胎牛血清的全血及組織稀釋液懸起（細(xì)胞濃度為2×10 8 -1×10 9 個(gè)/ml），備用。

人或各種動(dòng)物骨髓中性粒細(xì)胞分離液試劑盒
    1．取 1ml 骨髓細(xì)胞懸液（制備方法詳見“一、骨髓細(xì)胞的采集方法”）小心疊加在A 液之液面上（比例為1：1），20℃±2℃，500g（約1800 轉(zhuǎn)/分），離心25 分鐘（半徑15cm 水平轉(zhuǎn)子）。
     此時(shí)離心管中由上下細(xì)胞分四層。*層;為稀釋液層。第二層；為環(huán)狀乳白色的單個(gè)核細(xì)胞層。第三層；為略帶渾濁的分離液層（富集一定量的中性粒細(xì)胞）。第四層；為紅細(xì)胞層。棄去*層血漿層及第二層細(xì)胞，收集第三層細(xì)胞和第四層紅細(xì)胞層，放入含細(xì)胞洗滌液10毫升的試管中，充分混勻后，以500g（約1800 轉(zhuǎn)/分）離心30分鐘。沉淀經(jīng)1次洗滌后用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，再經(jīng)3次洗滌去除紅細(xì)胞內(nèi)容物和碎片后取沉淀細(xì)胞即為所需中性粒細(xì)胞。
注： 提取率約為80%。
    2. 紅細(xì)胞裂解過程詳見“三、紅細(xì)胞裂解液使用說明”。
分離圖例：
三 、 紅細(xì)胞裂解液使用說明
    紅細(xì)胞裂解液配方經(jīng)過本公司優(yōu)化，在裂解紅細(xì)胞的同時(shí)不損傷并在一定程度上保護(hù)淋巴細(xì)胞(lymphocyte)或其它有細(xì)胞核的細(xì)胞，所獲得的細(xì)胞可保持完好的生物活性和完整的細(xì)胞形態(tài)。另外，本裂解液中無 DNA 及 RNA 酶，配合細(xì)胞分離液使用所提細(xì)胞可廣泛用于細(xì)胞培養(yǎng)及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
    紅細(xì)胞裂解液(Red Blood Cell Lysis Buffer)，也稱 ACK Lysis Buffer，是一種用于從人或鼠等的血液或組織細(xì)胞樣品中裂解并去除無細(xì)胞核紅細(xì)胞的溶液。本裂解液不適用于有細(xì)胞核紅細(xì)胞的裂解，例如鳥或禽類的紅細(xì)胞。本裂解液經(jīng)過無菌處理，處理過的血液或組織細(xì)胞樣品可以用于后續(xù)的原代培養(yǎng)、細(xì)胞融合以及核酸或蛋白的提取及各種常規(guī)的分析和檢測(cè)。
 

使用說明：
    A.  對(duì)于組織細(xì)胞樣品 ：
     a. 新鮮組織經(jīng)過膠原酶或胰酶等消化處理，通過適當(dāng)方法分散成細(xì)胞懸液，離心棄上清。
     b. 加入 3-5 倍細(xì)胞體積的紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解 1-2 分鐘。例如細(xì)胞沉淀的體積為 1ml，則加入 3-5ml 的紅細(xì)胞裂解液。本步驟在室溫或 4 度操作均可。
     c. 400-500g 離心 5 分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。
     d. 如果發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞裂解不*，可以重復(fù)上述步驟 b 和步驟 c 一次。通常極微量的紅細(xì)胞不會(huì)影響后續(xù)的一些檢測(cè)。
     e. 洗滌 1-2 次：加入適量 PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液，重懸沉淀，400-500g 離心 2-3 分鐘，棄上清。可再重復(fù) 1 次，共洗滌 1-2 次。洗滌液的用量通常應(yīng)少為細(xì)胞沉淀體積的 5 倍。4℃離心效果更佳。
     f. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用適當(dāng)溶液重懸細(xì)胞沉淀后即可進(jìn)行計(jì)數(shù)等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

B.  對(duì)于組織細(xì)胞樣品無需洗滌的快速操作步驟 ：
    a. 新鮮組織經(jīng)過膠原酶或胰酶等消化處理，通過適當(dāng)方法分散成細(xì)胞懸液，離心棄上清。
    b. 對(duì)于 0.2ml 細(xì)胞沉淀加入 1ml 紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解 1-2 分鐘。本步驟在室溫或 4 度操作均可。
    c. 加入 15-20ml PBS、HBS S、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液，混勻。
    d. 400-500g 離心 5 分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。
    e. 如果發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞裂解不*，可以重復(fù)上述步驟 2 和步驟 3 一次。通常極微量的紅細(xì)胞不會(huì)影響后續(xù)的一些檢測(cè)。
    f. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用適當(dāng)溶液重懸細(xì)胞沉淀后即可進(jìn)行計(jì)數(shù)等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
注：對(duì)于常規(guī)步驟，多一步洗滌過程中的離心，但可以節(jié)省洗滌液的用量，并且洗滌效果也更好一些，同時(shí)不需要大體積的離心管?？焖俨襟E少了一次離心，但洗滌效果略差一些，同時(shí)需要大體積的離心管。
   C. 對(duì)于血液樣品 ：
    a. 取新鮮抗凝血，400-500g 離心 5 分鐘，離心棄上清。
    b. 加入 6-10 倍細(xì)胞體積的紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解 1-2 分鐘。例如細(xì)胞沉淀的體積為 1ml，則加入 6-10ml 的紅細(xì)胞裂解液。本步驟在室溫或 4 度操作均可。注意：對(duì)于鼠的血液，裂解 1-2 分鐘已經(jīng)足夠，對(duì)于人的外周血，宜延長裂解時(shí)間 4-5 分鐘，并且裂解過程中宜適當(dāng)偶爾搖動(dòng)以促進(jìn)紅細(xì)胞裂解。
    c. 400-500g 離心 5 分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。
    d. 如果發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞裂解不*，可以重復(fù)上述步驟 2 和步驟 3 一次。通常極微量的紅細(xì)胞不會(huì)影響后續(xù)的一些檢測(cè)。
    e. 洗滌 1-2 次：加入適量 PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液，重懸沉淀，400-500g 離心 2-3 分鐘，棄上清?？稍僦貜?fù) 1 次，共洗滌 1-2 次。洗滌液的用量通常應(yīng)少為細(xì)胞沉淀體積的 5 倍。4℃離心效果更佳。
    f. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用適當(dāng)溶液重懸細(xì)胞沉淀后即可進(jìn)行計(jì)數(shù)等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
注：對(duì)于微量或少量的血液樣品，可以在*步中不進(jìn)行離心棄上清的操作，直接在第二步中加入 10 倍血液體積的紅細(xì)胞裂解液，并在室溫或 4 ℃裂解 4 -5 分鐘。對(duì)于鼠的血液，裂解 4-5 分鐘已經(jīng)足夠，對(duì)于人的外周血，宜延長裂解時(shí)間 10 分鐘，但通常不宜超過 15 分鐘，并且裂解過程中宜適當(dāng)偶爾搖動(dòng)以促進(jìn)紅細(xì)胞裂解。后續(xù)步驟相同。
 

D.  對(duì)于血液樣品無需洗滌的快速操作步驟 ：
    a. 每 1ml 新鮮抗凝血中加入 10 ml 紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解 4-5 分鐘。本步驟在室溫或 4 度操作均可。注意：對(duì)于鼠的血液，裂解 4-5 分鐘已經(jīng)足夠，對(duì)于人的外周血，宜延長裂解時(shí)間 10 分鐘，但通常不宜超過 15 分鐘，并且裂解過程中宜適當(dāng)偶爾搖動(dòng)以促進(jìn)紅細(xì)胞裂解。
    b. 加入 20-30ml PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液，混勻。
    c. 400-500g 離心 5 分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。
    d. 如果發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞裂解不*，可以重復(fù)上述步驟 2 和步驟 3 一次。通常極微量的紅細(xì)胞不會(huì)影響后續(xù)的一些檢測(cè)。
    e. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用適當(dāng)溶液重懸細(xì)胞沉淀后即可進(jìn)行計(jì)數(shù)等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
注：對(duì)于常規(guī)步驟，多一步洗滌過程的離心，但可以節(jié)省洗滌液的用量，并且洗滌效果也更好一些，同時(shí)不需要大體積的離心管?？焖俨襟E少了一次離心，但洗滌效果略差一些，同時(shí)需要大體積的離心管。

四 、  注意事項(xiàng)
    A． 本分離液是敏光型的，在運(yùn)輸和貯藏過程中應(yīng)在18℃-25℃避光保存，啟封后置4℃保存避免微生物污染。另外，本品為真空包裝，未啟封前置于10℃ 以下易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。
    B． 待分離的樣本要求新鮮，避免冷凍和冷藏。分離液和所分離樣本一定在20℃水浴箱中復(fù)溫20 分鐘保證分離液和所分離樣本溫度在20℃±2℃時(shí)分離效果好，且所有操作過程一定要在無菌條件下進(jìn)行。
    C． 由于各品牌離心機(jī)的性能不同，國內(nèi)南北地區(qū)溫度環(huán)境和四季的差異，可能影響分離效果，用戶可以調(diào)節(jié)離心轉(zhuǎn)數(shù)，調(diào)節(jié)離心的時(shí)間，摸索的分離條件（具體分離條件各實(shí)驗(yàn)室自定）。
    D． 好使用無靜電反應(yīng)的離心管，推薦使用未經(jīng)過堿處理的玻璃離心管。

五 、 產(chǎn)品性能指標(biāo)

pH 7.0-7.5
滲透壓 280-340mOsmol/kg
內(nèi)毒素 ≤0.5EU/ml
無菌 直接接種培養(yǎng)14 天后培養(yǎng)基澄清
澄明度及不溶性顆粒物 每50ml 溶液中含10µm 以上的不溶性微粒20 粒以下，
含25µm 以上的不溶性微粒5 粒以下

六 、 貯藏及保存期限

     18℃-25℃避光保存，有效期兩年。啟封后置4℃保存，有效期一周。
     注：若保證無微生物污染，啟封后可置4℃長期保存。但應(yīng)注意保存溫度較低時(shí)本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。

兔腫瘤浸潤組織中性粒細(xì)胞分離液試劑盒訂購說明：

1、絕大部分產(chǎn)品備有現(xiàn)貨，一般情況下都能訂貨當(dāng)日發(fā)貨。 
2、部分非常用產(chǎn)品，需提前1－2日預(yù)訂，海外期貨則需要提前3-6周預(yù)訂。 
3、部分產(chǎn)品價(jià)格會(huì)因貨期、批次等因素發(fā)生變化，若有變動(dòng)以訂貨當(dāng)日新價(jià)格為準(zhǔn)。 
4、每日訂單截止時(shí)間為16點(diǎn)整，部分城市可到17點(diǎn)整，因超過截止時(shí)間造成當(dāng)日不能發(fā)貨的將于次日安排發(fā)貨。
5、請(qǐng)辦理完貨款后，將收據(jù)、底單等連同收貨人的地址、姓名、等以傳真、、短信、等形式通知我們。

運(yùn)輸說明：

1、極低溫產(chǎn)品：極低溫產(chǎn)品運(yùn)輸過程中加裝干冰運(yùn)輸。用干冰把產(chǎn)品包裹起來，再用泡沫盒密封，膠帶層層粘住泡沫盒，放入索萊寶的箱子，然后交付給合作快遞，安全快速高效放心的送客戶的手中，保證產(chǎn)品的性質(zhì)穩(wěn)定如一，為您的實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航。
2、低溫產(chǎn)品：低溫產(chǎn)品運(yùn)輸過程中加裝索萊寶冰袋運(yùn)輸。事先用冰袋把產(chǎn)品包裹起來，再使用泡沫盒密封，用膠帶嚴(yán)實(shí)密封泡沫盒，再放入索萊寶的箱子（保溫效果少可以持續(xù)一周），然后交付給合作快遞，安全快速高效放心的送客戶的手中，保證產(chǎn)品的性質(zhì)穩(wěn)定如一，為您的實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航。
3、常溫產(chǎn)品：常溫產(chǎn)品運(yùn)輸過程中無需加冰或者特殊包裝。產(chǎn)品由公司庫房人員快速配貨，準(zhǔn)確快速高效的快遞保證產(chǎn)品快速送達(dá)您的手中。